浅析微生物对烟草调制的影响

    烟叶的调制过程为烟叶微生物的生存提供了一个特殊环境。烟叶中的特殊物质、表面的脱落组织等往往是微生物生长因子的主要来源，因而影响烟叶发酵过程中微生物的组成和数量。但是烟叶发酵微生物也可通过活跃的分解与合成代谢，将复杂的有机化合物降解、转化，最后变成发酵过程中可利用的简单物质，从而催化了烟叶发酵过程的完成，促进烟叶中有意成分的形成和有害成分的降解、转化。从而提高烟叶的品级（曹玉等 1998）。　

　　烟叶上微生物对烟叶发酵起到催化作用。真菌中曲霉生长快，孢子萌发快，能产生酶分解利用有机物的微生物，且对环境有极强的耐受性，适应力，只要条件稍微适宜，便能随时大量繁殖而成为主要的优势类群。曲霉代谢活动复杂多样，能分解多种有机质如纤维素、半纤维素、果胶、木质素、淀粉、蛋白质等。细菌中的芽孢杆菌对环境有较强的耐受力，且具较强的分解复杂而难分解的有机物酶系统，能分解纤维素，淀粉，果胶质等。因此，芽孢杆菌在烟叶细菌类群中的优势存在，有利于烟叶的发酵，某些芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌还能产生杆菌肽类抗生素，用于烟叶病害的防治。当然对欧文氏菌属、肠细菌属等革兰氏阴性细菌中的某些种能产生抑制发酵或促进病原真菌生长的物质，造成烟叶的腐烂和霉变，须引起注意（曹玉等 1998）。　

　　一、细菌对储藏期烟叶内在质量和烘烤期烟叶品质的影响　　

　　中国烟草科技工作者在利用微生物进行烟叶发酵方面也作了一些研究，如陈福星等（1990）用从烤烟烟叶上分离鉴定的4个优势菌种(均属芽孢杆菌科的细菌)处理烟叶，试验结果表明，处理烟叶比人工或自然发酵的均好，不仅大大缩短了发酵时间，而且使烟叶品质及色香味均有一定的提高。韩锦峰等（1997）将由烤烟叶面分离筛选的芽孢杆菌属(Bacillus)和梭状芽孢杆菌属(Clostridium)优势菌种，混合配制成生物制剂(TFA)用于烟叶发酵，结果表明，TFA可加速烤烟发酵，提高烟叶品质，并且具有抑制烟叶霉变的作用。赵铭钦等（1998）利用4种由优势增香菌种和高生物活性的α-淀粉酶、蛋白酶等配制而成的烟草发酵增质剂，对人工发酵和自然陈化过程中的烤烟烟叶的增质增香效果进行了研究。结果表明，烟草发酵增质剂具有促进烟叶内部有机物质的分解与转化，加速烟叶发酵过程、缩短发酵周期等作用。与对照相比，经过发酵增质剂处理后的烟叶香气质改善，香气量增加，烟叶固有的杂气和刺激性减轻，烟叶内部的糖、氮、碱等主要化学成分及其比值趋于协调、平衡。谢和等 (1999)将枯草芽孢杆菌应用于烤烟发酵过程，经过45℃、65%的相对湿度发酵8 d后，化学成分分析结果显示，微生物对烟叶的总氮、蛋白氮、烟碱和总糖等成分的含量变化没有明显的影响，但对还原糖和蛋白氨基酸含量的变化影响显著。感官评吸结果表明，施加微生物的烟叶发酵后，青杂气减少，刺激性有所降低，香味略有增加，余味舒适。微生物发酵不仅能够显著地缩短烟叶醇化时间，而且在一定程度上可以提高烟叶的内在质量。English 等(1967)从发酵烟叶上分离出嗜热细菌，包括（Bacillus subtilis）、（B . coagulans）、（B . megaterium）、（B . cirulans），这些菌株单独或混合用于烟叶，都可产生宜人的香气。Inglixy(1999) (SI:郑小嘎等 2003a)报道用枯草杆菌( B.subtilis) 的三个菌系和芽孢杆菌(B.sp) 另一个种的一个菌株，采用单独接种或混合接种于贮藏期烟叶，烟叶香气明显提高。Kuochigy 等(1999) (SI:郑小嘎等 2003a) 报道假单孢杆菌属( Pseudomonas) 的菌悬液可提高卷烟的品质。　

　　最近，周瑾等 (2002)将从优质烤烟叶上分离筛选得到的微生物菌种Yu-1接种于灭菌后的低次烤烟碎片上，在28℃下发酵6 d，测定发酵前后烟叶碎片化学成分的结果表明，在发酵后的烟叶碎片中，还原糖含量明显降低，有机酸成分增多，酸值提高。用发酵烟叶碎片提取物进行香烟加香评吸试验，结果显示：与未发酵烟叶相比，发酵烤烟碎片提取物能显著降低卷烟的刺激性，掩盖杂气，改善吸味。此外，朱大恒等人（1997）提出了一种直接利用产香微生物发酵定向生产烟草香料的方法。该法是用烟末、烟秸秆、顶芽、腋芽和豆粕为原料，通过在原料上接入由烟叶上分离出的产香菌，于30～60℃下发酵5 d，再经过萃取、浓缩等步骤得到烟草生物香料，产率为8%。该香料为棕黄色树脂状物，具有浓郁的果香、坚果香、焦糖香、烤香、酱香、草药香和烟草香，加入卷烟后的评吸结果表明，该香料能显著地提高卷烟香气质量，使烟气醇和饱满，并能协调烟香，减轻杂气和刺激性，改善余味，可用于中、高档卷烟加香。　

　　张玉玲等（2004）研究表明：在烟草晾制的后期，WB5菌株处理可明显降低烟叶中TSNA 含量，在NNN、NNK、NA T + NAB四种化合物中，对NNN含量的降低作用最明显。而白肋烟中含量最多的是NNN，其降低白肋烟中TSNA 含量的稳定性及其作用机理等方面尚需进一步深入研究。研究报道，TSNA 的积累与烟叶上细菌的生长密切相关（Bush et al. 1979，Burton et al. 1989，Tso 1990，Wiernik et al. 1995，Burton et al. 1994）。祝明亮等（2004）报道从白肋烟上分离的内生细菌可降低烟草TSNA的含量。其作用机理可能是接种这些内生细菌后，由于其种群数量远大于引起TSNA 积累的自然微生物类群，抑制了它们的生长繁殖，而自身大量还原白肋烟叶内的硝酸盐和亚硝酸盐，减少了形成TSNA 的前体物质，导致白肋烟TSNA 含量下降。不同的接种处理方式影响了内生细菌进入烟叶组织的速度和数量，加上不同的生长环境，其还原硝酸盐、亚硝酸盐的量就不同，从而表现出烟叶TSNA 含量的差异。内生细菌由于直接接触粉碎烟叶和较易通过叶柄伤口进入烟叶组织细胞，而难于通过叶面气孔进入烟叶组织细胞，加上3 种处理方法烟叶水分含量逐渐降低，因而6 株内生细菌3 种接种方式降低TSNA 含量的百分率为粉碎烟叶接种最大，其次是叶柄接种， 叶面接种最小。$page$　

　　二、真菌和放线菌对烘烤期烟叶品质的影响　　

　　烟叶在陈化发酵过程中，表面有大量的微生物，数量因烤烟品种而有所不同，优良品种烤烟叶面微生物数量大，种类多，起着不可替代的作用。目前利用微生物制剂改善烟叶品质的研究已有报道（韩锦峰等1997，罗家基等1998，赵铭钦等1998，朱大恒等1997），但真菌方面的报道较少。Wentiligy(1999)(SI:郑小嘎等 2003a) 等人研究发现，酵母菌( Yeast) 有些菌株接种烤后储藏期烟叶上，3d 后可诱发烟叶产生诱人的香气。美国烟草双周刊125 卷25 期报道，将黑曲霉接种于烟丝，储藏于湿度25 %下，经过7d 认为是腐败的，但14d 后，同一烟丝由同一评价员鉴定认为是合意的。Henri C.Silberman(1967)发现用（Aspergillus niger ）或（A. oryzae ）培养发酵产生的多糖水解酶处理烟梗，使梗丝的填充力和挥发物的量显著增加，掺此梗丝的卷烟比未掺此梗丝的卷烟更受评吸专家的喜欢。Seaaich 等(1999) (SI:郑小嘎等 2003a)报道在卷烟前6d 喷洒链格孢( Alternaria)的孢子悬浮液可大大提高卷烟的香气。郑小嘎等（2003b）利用分离自不同生境烟叶上的7个真菌菌株菌剂处理上部叶烤烟烟丝，处理后烟叶内与品质相关的主要化学成分含量发生了改变，烟叶品质得到改善。其中菌株BF03、BF06及BF63使烟叶内糖、氮、烟碱、蛋白质等主要化学成分含量及各种成分之间比例趋于平衡。评吸结果表明，经供试菌剂处理的烟叶香气质提高，香气量增加，刺激性减小，余味舒适，烟叶品质明显高于对照。　

　　关于放线菌对烟叶品质的影响研究报告更少，只有Dawson（1965）曾报道：嗜热性放线菌属(（Thermophilic actinomyces）)在湿度非常低的醇化烟中生长缓慢，并可使醇化烟叶产生一种令人喜欢的水果香气和壤香香气。　

　　三、微生物酶制剂对烟草调制的影响　　

　　微生物对烟叶品质的作用机理，一方面认为是因为微生物种群数量的变化，控制了一些有害微生物的作用，另一方面某些微生物产生的酶类在烟叶发酵过程中起很重要的作用。微生物在其生长发育过程中可以向胞外分泌不同种类的酶，这些酶可以催化烟叶中某些物质的分解或合成。如 曲霉属和根霉属，能产生很多酶类，具有很强的酶活性，对于发酵很有利，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶、耐酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶等，有很强的分解、催化力。同时，又能产生抗生素和有机酸。有的种也会产毒素、抑制发酵，它会引起烟叶腐烂变质，甚至环境的污染。而在细菌中的芽孢杆菌属中的许多种都产生外源酶，如枯草芽孢杆菌产生淀粉酶、蛋白酶等，腊状芽孢杆菌能产生卵磷脂酶，这些都是烟叶发酵需要的酶类。对烟叶的微生物危害，也可通过生物防治来治理，如使用绿色木霉（曹玉等1998）和芽孢杆菌（赵文姬，2004）的生物拮抗作用来进行防治，提高酶类的活力，使烟叶微生物发酵得到最理想结果。　

　　另外可通过人工发酵的途径，如使用能产生酶的微生物复合制剂，改善发酵场所的微生物生态状况，调控发酵烟叶上的微生物区系，激活烟叶上酶类物质的催化，降解作用，产生合成烟碱及特殊的香料物质，提高烤烟的品级以获得良好收益。早在1965年，美国菲利浦·莫里斯公司的B.M.Spann等就对烟草薄片的酶处理进行过研究。他们将烟梗含量约50%的烟末制成固形物含量为12%～18%的稠浆，加入0.075%～0.75%(按干烟末重量计)的纤维素酶35，用乙酸或柠檬酸调节pH值到4.5(在pH=4.5下此酶的活性最高)，于室温下放置过夜发酵，然后按稠浆法制成烟草薄片。化学分析表明，此种薄片的水溶性物质、总还原性物质和还原糖的含量均高于原来的烟草原料，草酸铵可溶物、氯化钠和纤维素的量均较低，总灰分、苯-乙醇可溶物和半纤维素的量不变。评吸结果表明，用低量酶、甘油和乙酸处理的烟草薄片，刺激性较小，甜味较重，但缺乏“万宝路”卷烟中的生物碱劲头。　

　　C.F.Bailey和A.W.Petre（Bailey et al. 1973）对硝酸盐还原酶和蔗糖转化酶处理的烟叶进行了详细的研究，发现在温度为-9～39℃和相对湿度为80%～100%范围内，用硝酸盐还原酶和蔗糖转化酶处理烟叶，10d后，对于开始就发酵的烟叶已具有调制干草样的甜香，12d后甜香更浓，并带有香豆素的气息。此时停止发酵，将烟叶置于18～25℃的室温下，3d后香气不变。燃吸时烟气柔和、干味极轻，且涩味亦很小。又经过数天，除上述香气外，烟气还具有淡淡的清香。将这种处理后的样品取一小部分，除去0.5%的水，并于-9℃下放置14 h，结果除质量改善外，香气稍有提高。然而这种开始就发酵的烟叶，是此试验阶段得到的最佳样品。开始就冷藏的烟叶样品产生甜香的速度较为缓慢，19d后烟气才甜香、柔和，并具有轻微的刺激性。将这种烟叶取一部分于18～25℃温度下放置6d，甜香消失，烟味变浓。另一部分于21℃下放置7d，甜香未变，但产生一种淡淡的丁酸气香。Henri C.Silberman (Silberman 1967 ) 发明了一种改善烟梗品质的方法，即在压梗前，先将烟梗浸入含一定量多糖水解酶的水溶液中，用乙酸调节pH值至3.5～6.0的最佳范围内，浸入时间为5～30 min，然后排出剩余的溶液。烟梗于20～80℃温度下陈化15 min至24h，温度越高，陈化时间越短。再按常规方法压切烟梗。处理液中可加入有助于烟梗软化的甘油、丙二醇或三甘醇，还可以加入增香剂、烟草提取物或其它料剂。该发明所用的多糖水解酶为果胶酶、半纤维酶和纤维素酶。这些酶是在（Aspergillus niger）或（Aspergillus oryaze）(稻曲霉)培养物中发现的。试验结果表明，酶处理的烟梗柔软，易于压扁、切丝，且其梗丝的填充力和挥发物的量显著增大，总粒相物大幅度降低，并且掺兑此梗丝的卷烟受到评吸专家们的喜爱。　

　　近两年，中国在利用酶制剂改善烟叶品质方面也进行了一些探索性的研究。如张立昌(2001)报道了用从酵母菌B13分离醇化的酶制剂(主要含有中性蛋白酶、糖化酶、果胶酶和纤维素酶)处理打叶复烤后的陕西B2L烟叶烟丝，100g烟丝加酶量为0.5g，于30℃下作用24 h。评吸结果显示，酶制剂处理烟丝可明显改善卷烟香气，减轻青杂气和刺激性，使低等级的烟叶提升1～2个等级。其他学者研究了不同复合酶制剂如α-淀粉酶和糖化酶的组合，蛋白酶、淀粉酶和糖化酶的组合，（李晓等，2001；李晓等，2002）以及酶和微生物综合应用（马林，2001）对烟叶的降解作用，经过酶复合制剂或酶与微生物综合处理后的烟叶香气质变好，杂气和刺激性减轻，烟气甜度增大，余味变好，劲头有所降低，烟叶总体质量得到提高。应用酶制剂改善烟叶的品质是未来发展的方向之一。